Polysciences 24765-1試劑

一、貼壁細胞轉染：Polysciences 24765-1試劑

以293T細胞爲例，需要精確(què)控制轉染條件以確(què)保*高效率。以下是具體(tǐ)步驟：

細胞準備：

使用膠原酶處理細胞並(bìng)計數。在6孔闆中以每孔2×106細胞接種。每孔加入2 mL新鮮的DMEM/F12+5%FBS 培養基和1 mL的細胞懸液，置於(yú)37℃，5%CO2培養箱培養24 h。24 h後,移除之前培養基，每孔加入2 mL新鮮的DMEM/F12+5%FBS。

轉染過程：

1.檢查細胞彙(huì)合度
，達(dá)到70%-80%時開始轉染。

2.分别用兩份100 µL無血清培養基稀釋DNA，使DNA終濃度爲1 µg/ml（DNA/總培養體積(jī)）和适當(dāng)比例的适量Polysciences 24765-1。DNA:PEI 的比例要依據自己實驗摸索最适比例。

3.将稀釋的Polysciences 24765-1轉染試劑(jì)與質粒（總體積(jī)200 µL）輕輕混勻，室溫孵育30 分鍾。

4.PEI-DNA 複合物滴加到細胞培養闆每個孔中，輕搖混勻。注意輕輕沿著(zhe)孔闆邊(biān)緣滴入，以免破壞細胞的粘附性。

5.将培養(yǎng)闆(bǎn)放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24 h。

結果觀察：

在24小時後使用熒光顯微鏡觀(guān)察轉染效果，超過(guò)80%的293T 細胞在轉染後的24 h可以觀(guān)察到綠色熒光。

二

、懸浮細胞轉染：Polysciences 24765-1試劑

懸浮細胞轉染步驟略有不同，小規(guī)模轉染時，用新鮮的培養基重懸浮，使細胞密度達(dá)到 1×106cells/mL，如需大規(guī)模轉染細胞密度要到達(dá)2-3×106cellsml/mL。

以293F細胞爲例：

細胞準備：

傳代接種於(yú)20 mL 懸浮細胞生長(zhǎng)培養基中(36.5℃，120 rpm，5%CO2 )培養細胞至1×106 cells/mL的密度，旋緊瓶口放入搖床，2~4 小時後可以進行轉染。

轉染過程：

1.用1 mL無血清培養基稀釋适量的DNA，使DNA 終濃度爲1 µg/ml，混勻並(bìng)靜(jìng)置5 min。

2.用1 mLOptiPRO

SFM(無血清培養基)稀釋适當(dāng)比例的PEI 40000，混勻並(bìng)靜置10 min。

3.将稀釋的24765-1轉染試劑(jì)與質粒輕(qīng)輕(qīng)混勻，室溫孵育30分鍾。

4.将PEI-DNA 轉染複(fù)合物逐滴加入到細胞培養液中，搖勻後(hòu)旋緊瓶口放回搖床（36.5℃，5%CO2，120 rpm）。

5.基因表達可在24-72小時後檢測(cè)，時間取決於(yú)細胞系和轉基因。